Jezioro Mikołajskie położone jest na Szlaku Wielkich Jezior Mazurskich. Cechą zbiornika jest jego położenie, ponieważ łączy się z innymi dużymi mazurskimi jeziorami, dzięki temu można dostać się na inne akweny wodne korzystając tylko i wyłącznie z drogi wodnej.
Jezioro Mikołajskie rozciąga się od mostu drogowego w Mikołajkach, gdzie umownie łączy się z Teziorem Tałty, aż po cypel półwyspu Popielskiego Rogu, który wyznacza południowo-zachodnią granicę z Jeziorem Bełdany, zaś od strony południowo-wschodniej łączy się z Jeziorem Śniardwy przez Przeczkę, cieśninę między Dybowskim a Popielskim Rogiem. Nie istnieją wyraźne granice między jeziorami, wyznaczają je miejsca przewężeń. Akwen zasilany jest wodami jeziora Tałty, od północy i Bełdany od południa. Na zachodnim brzegu jeziora rozciąga się Puszcza Piska.
Na jeziorze znajdują się trzy wyspy. Dno jeziora jest urozmaicone, z licznymi głęboczkami, liczne zatoki świadczą o dobrze rozwiniętej linii brzegowej. Roślinność to 20% powierzchni jeziora, połowa to roślinność zanurzona, w bezpośrednim otoczeniu jeziora dominuje las, oraz grunty orne i nieużytki. Brzegi jeziora na ogół wysokie, w południowo-wschodniej części płaskie.